Regina Célia Pereira Marques

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O projeto visa identificar genes envolvidos em reparo de DNA na proteobactéria, subdivisão alfa, Caulobacter crescentus através de uma abordagem genômica funcional. Para isso selecionamos mutantes dessa bactéria com sensibilidade a agentes genotóxicos (metil-metano-sulfonato e UV). Esses mutantes foram obtidos a partir de uma biblioteca de aproximadamente 5000 clones, mutada por inserção aleatória do transposon Tn5 (que inclui o gene kan , que dá resistência a kanamicina), e a abordagem foi realizada por testes em larga escala (96 clones testados a cada vez), e posterior confirmação do fenótipo (sensível ao agente genotóxico) individual. Genes contendo o inserto, Tn5, foram selecionados a partir do clone mutado através de clivagem do genoma bacteriano com enzima de restrição, subclonagem em plasmídeo e seleção com kanamicina. Sequenciamento de DNA a partir do DNA do transposon permitiu identificar as regiões flanqueadoras do tn5 e, portanto, a identidade do gene mutado. Pretendemos ainda identificar, através de análise bioinformática, genes novos que potencialmente estejam relacionadas a reparo de DNA em Caulobacter, muito embora não estejam descritos para Escherichia coli. Alguns candidatos já foram encontrados, entre eles uma ligase dependente de ATP, ligB, e uma nova DNA polimerase, dnaE2(Galhardo et al., 2005) e pretendemos, através de genética reversa- inativação do gene de interesse, identificar seu fenótipo quanto a sensibilidade a agente genotóxico e mutagencidade. Esta é, de nosso conhecimento, a primeira abordagem genômica para identificação de genes de reparo de DNA em bactérias, e a nossa expectativa é de que consigamos demonstrar a função de vários ortólogos já identificados em E.coli, além de identificar genes cuja função em reparo de DNA ainda não foi descrita.