AULA 8 - Filogenia Molecular e
evolução
OBS.: Esta
aula é baseada no programa MEGA, que você pode obter de
graça na Internet.
Se você tem o PAUP instalado num Mac tente as
questões aqui
Veja uma revisão recente sobre o MEGA aqui
1. Input de alinhamento:
- Procure por lipocalin no site do HomoloGene do NCBI.
- Na lista gerada procure pela major urinary protein de Mus musculus (HomoloGene:7434).
- Entenda qual a função dessas proteínas lendo o resumo de um dos artigos listados na página.
- No topo da página das major urinary proteins à direita em cima, clique em Download.
- Na página seguinte abre-se um box que lista os genes, os mRNAs e as sequências de aminoácidos das proteínas.
- Escolha todas e faça o download de Protein e mRNA.
- Essas proteínas são parálogas ou ortólogas?
- O arquivo salvo no seu disco deve conter 22 sequências.
- Edite as sequências, removendo toda informação supérflua do cabeçalho (a linha que contem o síbolo de ">") ou seja, deixe só o nome do gene (Mupn).
- Alinhe todas as sequências (nucleotídeos e aminoácidos) utilizando o CLUSTALX ver. 2 que você acabou de instalar no Windows.
- Salve os alinhamentos no formato Clustal.
2. Converta para um formato legível (via MEGA)
- Instale o MEGA (http://www.megasoftware.net/)
no seu computador.
- Abra o programa clicando no ícone e clique em Tutorial
on how to use MEGA
.
- Transforme o arquivo das MUPs alinhadas (aminoácidos) no Cluxtal X via File ->
Convert to Mega na barra de comandos.
- Salve o arquivo no formato Mega (x.meg) no mesmo
diretório.
3.
Abra o arquivo x.meg no MEGA
- Em "Input Data" escolha Protein Sequences.
- Mantenha os outros parâmetros no "default"
("Alignment Gap", etc.)
- Aumente a janela "Sequence Data Eplorer" e teste
os diferentes botões.
- Na barra de menus clique em "Pattern" e
calcule "Compostiion Distance" e "Pattern Disparity Index". O que eles
significam?
4.
Análise da árvore baseada em Evolução
Mínima (ME)
- Use o alinhamento para construir uma
árvore usando o método de "Minimum Evolution" (ME)
clicando em "Phylogeny".
- Observe as opções e teste cada um
delas.
- Observe o resultado obtido. Ele tem algum
significado biológico?
- Salve a árvore na opção
"Export Current Tree" do "Tree Explorer".
- Instale o programa "TreeView"
ou FigTree no seu computador.
- Abra o arquivo contendo a árvore salva
anteriormente no programa "TreeView"
- Mude o modo de exibição. O
significado biológico da árvore se altera? Essa é
uma árvore com raiz ou sem raiz?.
- Quantas mudanças de aminoácidos
ocorrem no ramo mais curto e no ramo mais longo da sua árvore?
Quais OTUs (taxa) estão conectados por esses ramos?
3.
Avaliação da árvore pelo teste de "bootstrap"
O teste de "bootstrap" é um outro tipo de
teste de re-amostragem. O princípio é colher amostras
aleatórias de cada uma das colunas de sequências de
aminoácidos alinhadas originalmente. Os dados
recém-gerados terão tamanho idêntico ao alinhamento
original. O "bootstrap" descreve o porcento de vezes que um dado clado
é apoiado.
- Faça o teste de "bootstrap". Na
janela Analysis Preferences do menu Phylogeny clique na aba Test
of Phylogeny. Então troque o número de amostragem. Tente
1000 e 10.000 replicas de amostragem.
- Analise a árvore com 10.000
réplicas de amostragem. Baseado nos seus valores de “bootstrap”,
quantos clados fortemente apoiados (valores de "bootstrap" > 70%)
estão presentes na sua árvore e quais taxa eles
compreendem?
- Pode você determinar se membros de um clado
particular são parálogos ou ortólogos? Que tipo de
informação você precisa para fazer esta
inferência?
5.
Mude os arquivos de entrada
- Use as sequências de nucleotídeos dos mRNAS das MUPs para fazer um novo alinhamento.
- Repita o exercício acima e observe as
diferenças.
6.
Análise de árvores por outros métodos
- Teste as outras opções da
opção Phylogeny na barra de comandos.
- Uma árvore baseada no método de
máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) a partir de alinhamentos de
sequências de aminoácidos pode ser criada com o
programa Puzzle (http://www.tree-puzzle.de).
- Existem diferenças na topologia destas
árvores para um mesmo alinhamento? Eles afetam as
conclusões sobre as relações biológicas
entre as OTUs?