AULA 08 - Filogenia Molecular e evolução

2. Converta para um formato legível (via Conversion Tools do EBI)

• Abra uma nova janela no seu “browser” e vá para a página do Sequence Format Conversion Tools (https://www.ebi.ac.uk/Tools/sfc/emboss_seqret/).
• Cole suas sequências em FASTA na janela do EMBOSS Seqret. Escolha o formato Nexus/paup interleaved format como output. De um clique duplo em SUBMIT).
• Pegue o alinhamento gerado e copie no “clipboard” de seu computador. Ou então copie-o num arquivo de texto do Notepad. Comece a cópia com “#NEXUS” e termine com os símbolos “end;”.

3. Importe para o PAUP

• Abra o programa PAUP.
• Abra um novo arquivo em “File”, “New”.
• Cole o seu alinhamento.
• No menu de “File”, escolha “Execute”.
• Se voce receber uma mensagem de erro voce deve tentar diversas alternativas tais como.
• Procure a linha “format datatype=protein interleave missing=-;” e mude o hífen (-) nesta linha por um ponto (.)
• Em “Edit” escolha “Find”. Troque em todos os pontos o símbolo “/” por “_”.
• Quando o comendo “Execute” tiver sucesso, voce será notificado que “Data matrix has 10 taxa (i.e., 10 proteínas) and 163 caracteres (aminoácidos)”.

3. Análise da árvore baseada em Parcimônia Máxima (MP)

(a)    Procura heurística

• Em “Analysis”, selecione “Parsimony”.
• Em “Analysis”, escolha “Heuristic search”. Clique “Search” e use as definições “default” para encontrar a árvore.
• Uma vez que a procura termina, a pequena janela com “Heuristic Search Status” terá um ícone clicável de fechamento (“close”). O programa descre o número de rearranjos de árvores que foram tentados e os “scores” para a(s) melhor(es) árvore(s).
• Olhe a árvore. Vá até o menu de “Trees” e escolha “Print Tree”. Voce terá a opção de ver um filograma ou cladograma sem raiz entre diversas opções. Na apresentação do filograma, o comprimento dos ramos são proporcionais às mudanças de aminoácidos, e a árvore é acompanhada por uma barra de escala. Por outro lado, os comprimentos dos ramos não são proporcionais a mudanças de aminoácidos no cladograma. Um cladograma mostra relações evolutivas dentro de espécies e populações. Além disso se voce tiver achado mais de uma árvore com o mesmo “best score”, voce terá a opção de ver uma determinada árvore individualmente ou mosrar todas as árvore ao mesmo tempo.
• Quantas mudanças de aminoácidos ocorrem no ramo mais curto e no ramo mais longo da sua árvore? Quais OTUs (taxa) estão conectados por esses ramos?
• Se voce tiver mais de uma árvore, voce pode escolher uma árvore consenso. No menu “Trees”, selecione “Compute consensus”.

(b)   Avaliação das Árvores

a.O princípio do teste da árvore aleatória é comparar o “score” da árvore encontrada a distribuição de valores de “score” de X árvores geradas aleatoriamente começando com o seu alinhamento.

• Avalie a árvore por distribuição de freqüência dos comprimentos de 100, 1000 e 10.000 árvores aleatórias.
• Vá ao ícone “Analysis” e use a opção “Evaluate random tree”. Mude o número de árvores aleatórias e veja como a média e o desvio padrão se alteram.
• O “score” da sua árvore encontrada por busca heurística é significantemente melhor que a distribuição de “scores” das árvores geradas aleatoriamente?
• Faça de novo uma busca heurísitca pela árvore mais parcimoniosa e cheque o “score”. Quão bom é o “score” desta vez? Uma vez que voce está trabalhando com alinhamento de proteínas de 10 taxa (OTUs), nós podemos fazer uma busca exaustiva para a árvore com parcimônia máxima. Vá a “Analysis” e escolha “Exhaustive search”. Que “score” voce obteve e qual o valor em relação ao(s) “score(s)” que voce obteve usando a estratégia heurística?

b.      O teste de “bootstrap” é um outro tipo de teste de re-amostragem. O princípio é colher amostras aleatórias de cada uma das colunas de sequências de aminoácidos alinhadas originalmente. Os dados recém-gerados terão tamanho idêntico ao alinhamento original. O “bootstrap” descreve o porcento de vezes que um dado clado é apoiado.

• Faça o teste de “bootstrap”. Vá no ícone “Analsis” e escolha “Bootstrap/Jacknife”. Então troque o número de amostragem. Tente 1000 e 10.000 replicas de amostragem com “replacement”.
• Após cada teste voce pode ver a árvore -> “Trees” -> “Print” -> “Bootstrap Consensus” -> “Preview”. (O tipo de gráfico deve ser mudado para “unrooted”).
• Analise a árvore com 10.000 réplicas de amostragem. Baseado nos seus valores de “bootstrap”, quantos clados fortemente apoiados (valores de “bootstrap” > 70%) estão presentes na sua árvore e quais taxa eles compreendem?
• Pode voce determinar se membros de um clado particular são parálogos ou ortólogos? Que tipo de informação voce precisa para fazer esta inferência?

5. Mude os arquivos de entrada
• Volte para o banco de dados CDD e recupere a família de lipocalina “pfam00061” (pontos 1-3 na questão 1 desta aula).
• Ao invés de escolher “10 most diverse sequences” como está no default (veja ponto 4 da questão 1), escolha “top listed sequences” na opção de sequências do alinhamento que será enviado. (alternativamente, p.ex., voce pode aumentar o input de sequências até 25).
• Repita o exercício acima e observe as diferenças.
• Voce pode ajustar o “input” de sequências. Escolha a opção “Selected sequences” e teste as sequências escolhidas listadas em baixo deste menu (veja o ponto 4 da questão 1).
• Análise de árvores baseado em método de distância. Este método é baseado na comparação do número de diferenças por pares em sequências e o uso das distâncias computadas entre as sequências para construir uma árvore. Infelizmente, algumas destas mutações (especialmente se voce está construindo uma árvore de DNA e não uma de proteína) pode passar desapercebida se a mutação ocorre em seguida a outra que volta para o caráter original.

Em “Analysis” escolha a opção “Distance”. Então faça uma procura heurística pela árvore. Veja a árvore e veja se os taxa (OTUs) se separam como eles fizeram no método de parcimônia máxima. Além disso, faça uma avaliação da sua árvore com teste aleatório e “bootstrap” como voce fez com a árvore acima.

• Análise de árvores baseado no método de máxima verossimilhança. Este é um método de construção de árvore baseado em caracteres (como o método de parcimônia). Neste caso, as árvores são avaliadas baseado na verossimilhança de produzir os dados observados. O programa PAUP permitirá que voce construa a árvore somente com sequências alinhadas de DNA.

Um método de obter sequências alinhadas de DNA é recuperar o alinhamento do banco de dadosPopSet. (vá ao domínio do NCBI e escolha Entrez -> clique PopSet -> procure no PopSet o seu alinhamento favorito). Cole o alinhamento formatado para PHYLIP do PopSet no ReadSeq e faça como acima.

Uma árvore baseada no método de máxima verossimilhança a partir de alinhamentos de sequências de aminoácidos pode ser criada com o programa Puzzle (http://www.tree-puzzle.de).