Leonardo Carmo de Andrade Lima

From Laboratório de Reparo de DNA

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-|Sou estudante de graduação de Ciências Biológicas na Universidade de São Paulo, atualmente no terceiro ano. Desenvolvo um projeto de iniciação científica com co-orientação da Dra. Keronninn Moreno de Lima Bessa e apoio da FAPESP, intitulado: '''Efeito da modulação da expressão de ATR e polη em respostas celulares induzidas por UVB'''. + 
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-|colspan="2"|+Formado em Bacharelado em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo e atualmente no programa de Doutorado Direto pelo Departamento de Microbiologia do ICB-USP. Desenvolvo um projeto, com apoio da FAPESP, intitulado: '''Interação entre vias de reparo de DNA e sinalização em resposta a danos através de silenciamento gênico'''.
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== Resumo do Projeto == == Resumo do Projeto ==
-Com o potencial que a luz ultravioleta tem em lesionar o DNA nos seres vivos, foram selecionados evolutivamente mecanismos celulares, como reparo e tolerância a danos no DNA, além de maquinarias de checagem que coordenam a progressão do ciclo celular e mantém a estabilidade e manutenção do material genético. A proteína ATR possui papel central e coordena essa sinalização de checagem de danos no DNA, sendo ativada por simples quebras e forquilhas de replicação bloqueadas, eventos comumente encontrados após UV, o que resulta em atraso ou parada do ciclo celular possibilitando tempo para reparo adequado desses danos. Para esse reparo, a via mais flexível e versátil é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER), o qual reconhece lesões que promovem distorções na dupla hélice do DNA. Outro mecanismo que a célula utiliza em conjunto ao reparo é a tolerância aos danos, através de DNA polimerases, que conseguem ultrapassar as lesões devido a sítios catalíticos mais abertos acomodando grandes lesões, fazendo a síntese translesão (TLS). Com destaque para polη, a qual é expressa pelo gene XPV. Desta forma, pretendemos neste projeto empregar o mecanismo de RNAi para induzir o silenciamento dos genes ATR e XPV, com vista a obter informações de como células humanas, principalmente aquelas com deficiência em NER, se comportam após irradiação UVB. Para isso, utilizaremos ensaios de sobrevivência e de citometria de fluxo para investigar a sensibilidade dessas células.+A luz ultravioleta (UV) e alguns agentes químicos interagem e promovem grandes distorções na estrutura do DNA, o que compromete mecanismos vitais para a célula por promover um bloqueio físico das maquinarias de replicação do DNA e transcrição de RNA. Em resposta a estes agentes, células de mamíferos ativam uma complexa sinalização em resposta a danos na molécula de DNA que coordenam a progressão do ciclo celular, vias de reparo de DNA e indução de morte celular. Como estratégia, as células podem remover as lesões, através de vias de reparo de DNA, ou tolerá-las, através de polimerases específicas que transpõem as lesões. Como peça-chave em toda a sinalização estão quinases responsáveis por transduzir os sinais que coordenam a resposta celular a esse tipo de agravo. Porém, como estas quinases interagem com as vias de reparo e de tolerância a danos no DNA ainda não são totalmente conhecidas.
 + Neste projeto, estudaremos a interação entre a sinalização em resposta a danos no DNA, mediado pelas quinases ATR e DNA-PK, com a via de reparo de DNA GGR-NER e o mecanismo de tolerância a lesões mediado pela polimerase η (codificada pelo gene XPV), através da busca de possíveis efeitos sinergísticos em resposta a agentes que geram lesões que distorcem a dupla-hélice no DNA, UVB e o quimioterápico cisplatina. Para isso, geraremos células com duplas-deficiências nos produtos dos genes XPV, XPC, ATR e DNA-PK, através de interferência por RNA (siRNA). Com essas células, realizaremos uma investigação sobre o efeito da depleção dessas proteínas na sensibilidade das células através da quantificação de lesões no DNA, da sobrevivência e morte celular. Além disso, pretendemos desenvolver uma metodologia para silenciamento de 16 genes envolvidos em reparo de DNA, em células deficientes em NER, empregando lentivírus recombinantes expressando shRNA direcionado a esses genes. Desta forma, pretendemos explorar e identificar interações entre NER e outras vias de reparo de DNA.
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 +<center>[[Image:Leo_Lima2.jpg|450px|]]</center>
 +'''Legenda''': Resposta ao dano no DNA após luz UV: integrando ciclo celular com tolerância e reparo de DNA.
 +'''A)''' Fibroblasto normal de pele não irradiado tem progressão normal pelo ciclo celular. Ao centro, visualização do perfil de ciclo celular mostrando 2 picos, correspondendo a G1 (em maior número por ter tempo maior de duração) e G2.
 +'''B)''' Fibroblasto irradiado com luz UV tem ativação da quinase ATR e de p53, resultando em acúmulo de células em G1 (checkpoint G1).
 +'''C)''' Fibroblasto transformado (Ex. SV-40) não possui p53 ativo, dessa forma células irradiadas progridem com danos no DNA pelo ciclo celular através de síntese translesão, realizada principalmente por Pol eta. Como lesões persistem, ativação de ATR provocará acúmulo de células em G2, antes que células entrem em mitose ainda com danos (checkpoint G2/M).
 +'''D)''' Fibroblasto transformado (Ex. SV-40) que não possui p53 ativo e é deficiente em Pol eta (pacientes da síndrome Xeroderma Pigmentosun Variante) possui em bloqueio da replicação após irradiação com luz UV pela deficiência na síntese translesão. Dessa forma, ATR é ativado em fase S, provoca acúmulo de células nesta fase do ciclo (checkpoint intra-S) e resulta em maior morte celular, visualizado ao centro pelo aumento de células com conteúdo sub-G1 de DNA.
==Publicações== ==Publicações==
-Por enquanto nenhuma...+1.'''Andrade-Lima, L. C.'''; Jogo da Resposta ao Dano no DNA. Revista Genética na Escola. Vol IX, artigo 6. 2014 (http://geneticanaescola.com.br/vol-ix1-artigo-06/)
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 +2. Veloso A, Biewen B, Paulsen MT, Berg N, '''Carmo de Andrade Lima L''', Prasad J, Bedi K, Magnuson B, Wilson TE, Ljungman M.; Genome-wide transcriptional effects of the anti-cancer agent camptothecin. PLoS One. 2013 Oct 23;8(10) (http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0078190)
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 +3.Kobayashi GS, Alvizi L, Sunaga DY, Francis-West P, Kuta A, Almada BV, Ferreira SG, '''de Andrade-Lima LC''', Bueno DF, Raposo-Amaral CE, Menck CF, Passos-Bueno MR.; Susceptibility to DNA damage as a molecular mechanism for non-syndromic cleft lip and palate. PLoS One. 2013 Jun 12;8(6) (http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0065677)
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 +4.Maria Berra C, de Oliveira CS, Machado Garcia CC, Reily Rocha CR, Koch Lerner L, '''de Andrade Lima LC''', da Silva Baptista M, Martins Menck CF.; Nucleotide excision repair activity on DNA damage induced by photoactivated methylene blue. Free Radic Biol Med. 2013 Apr 6;61C:343-356 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584913001317)

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Formado em Bacharelado em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo e atualmente no programa de Doutorado Direto pelo Departamento de Microbiologia do ICB-USP. Desenvolvo um projeto, com apoio da FAPESP, intitulado: Interação entre vias de reparo de DNA e sinalização em resposta a danos através de silenciamento gênico.

Resumo do Projeto

A luz ultravioleta (UV) e alguns agentes químicos interagem e promovem grandes distorções na estrutura do DNA, o que compromete mecanismos vitais para a célula por promover um bloqueio físico das maquinarias de replicação do DNA e transcrição de RNA. Em resposta a estes agentes, células de mamíferos ativam uma complexa sinalização em resposta a danos na molécula de DNA que coordenam a progressão do ciclo celular, vias de reparo de DNA e indução de morte celular. Como estratégia, as células podem remover as lesões, através de vias de reparo de DNA, ou tolerá-las, através de polimerases específicas que transpõem as lesões. Como peça-chave em toda a sinalização estão quinases responsáveis por transduzir os sinais que coordenam a resposta celular a esse tipo de agravo. Porém, como estas quinases interagem com as vias de reparo e de tolerância a danos no DNA ainda não são totalmente conhecidas. Neste projeto, estudaremos a interação entre a sinalização em resposta a danos no DNA, mediado pelas quinases ATR e DNA-PK, com a via de reparo de DNA GGR-NER e o mecanismo de tolerância a lesões mediado pela polimerase η (codificada pelo gene XPV), através da busca de possíveis efeitos sinergísticos em resposta a agentes que geram lesões que distorcem a dupla-hélice no DNA, UVB e o quimioterápico cisplatina. Para isso, geraremos células com duplas-deficiências nos produtos dos genes XPV, XPC, ATR e DNA-PK, através de interferência por RNA (siRNA). Com essas células, realizaremos uma investigação sobre o efeito da depleção dessas proteínas na sensibilidade das células através da quantificação de lesões no DNA, da sobrevivência e morte celular. Além disso, pretendemos desenvolver uma metodologia para silenciamento de 16 genes envolvidos em reparo de DNA, em células deficientes em NER, empregando lentivírus recombinantes expressando shRNA direcionado a esses genes. Desta forma, pretendemos explorar e identificar interações entre NER e outras vias de reparo de DNA.

Legenda: Resposta ao dano no DNA após luz UV: integrando ciclo celular com tolerância e reparo de DNA. A) Fibroblasto normal de pele não irradiado tem progressão normal pelo ciclo celular. Ao centro, visualização do perfil de ciclo celular mostrando 2 picos, correspondendo a G1 (em maior número por ter tempo maior de duração) e G2. B) Fibroblasto irradiado com luz UV tem ativação da quinase ATR e de p53, resultando em acúmulo de células em G1 (checkpoint G1). C) Fibroblasto transformado (Ex. SV-40) não possui p53 ativo, dessa forma células irradiadas progridem com danos no DNA pelo ciclo celular através de síntese translesão, realizada principalmente por Pol eta. Como lesões persistem, ativação de ATR provocará acúmulo de células em G2, antes que células entrem em mitose ainda com danos (checkpoint G2/M). D) Fibroblasto transformado (Ex. SV-40) que não possui p53 ativo e é deficiente em Pol eta (pacientes da síndrome Xeroderma Pigmentosun Variante) possui em bloqueio da replicação após irradiação com luz UV pela deficiência na síntese translesão. Dessa forma, ATR é ativado em fase S, provoca acúmulo de células nesta fase do ciclo (checkpoint intra-S) e resulta em maior morte celular, visualizado ao centro pelo aumento de células com conteúdo sub-G1 de DNA.

Publicações

1.Andrade-Lima, L. C.; Jogo da Resposta ao Dano no DNA. Revista Genética na Escola. Vol IX, artigo 6. 2014 (http://geneticanaescola.com.br/vol-ix1-artigo-06/)

2. Veloso A, Biewen B, Paulsen MT, Berg N, Carmo de Andrade Lima L, Prasad J, Bedi K, Magnuson B, Wilson TE, Ljungman M.; Genome-wide transcriptional effects of the anti-cancer agent camptothecin. PLoS One. 2013 Oct 23;8(10) (http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0078190)

3.Kobayashi GS, Alvizi L, Sunaga DY, Francis-West P, Kuta A, Almada BV, Ferreira SG, de Andrade-Lima LC, Bueno DF, Raposo-Amaral CE, Menck CF, Passos-Bueno MR.; Susceptibility to DNA damage as a molecular mechanism for non-syndromic cleft lip and palate. PLoS One. 2013 Jun 12;8(6) (http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0065677)

4.Maria Berra C, de Oliveira CS, Machado Garcia CC, Reily Rocha CR, Koch Lerner L, de Andrade Lima LC, da Silva Baptista M, Martins Menck CF.; Nucleotide excision repair activity on DNA damage induced by photoactivated methylene blue. Free Radic Biol Med. 2013 Apr 6;61C:343-356 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584913001317)

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