Barbara Cortat
From Laboratório de Reparo de DNA
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- | A luz ultravioleta induz no DNA a formação de ligações covalentes entre nucleotídeos de pirimidinas adjacentes, que provocam distorções estruturais na dupla hélice. As lesões mais comuns são dímeros de pirimidina, como o ciclobutano de pirimidina (CPD) e a 6-4 pirimidina-pirimidona ((6-4)PP). Um dos mecanismos utilizados pelas células para remoção dessas lesões é a fotorreativação, uma forma de reparo direto que se caracteriza por ter uma única enzima (fotoliase) para remover estas lesões empregando a energia de luz solar (300-500 nm). Dois tipos de fotoliases foram identificados na natureza: uma específica para CPD (CPD-fotoliase), e outra específica para (6-4)PP ((6-4)-fotoliase). O presente trabalho pretende a subclonagem de genes que codificam CPD-fotoliase e (6-4)-fotoliase em plasmídeos de expressão bacteriana. Os plasmídeos construídos devem permitir a obtenção de boas quantidades das respectivas proteínas, cuja atividade será testada in vitro. Com a obtenção das duas proteínas purificadas, poderemos realizar vários projetos que buscam identificar a importância relativa destas duas lesões em vários efeitos deletérios de luz UV de diferentes comprimentos de onda (UVA, UVB, UVC e luz solar.. | + | A luz ultravioleta (UV) pode ser absorvida por diferentes moléculas celulares, incluindo o DNA, no qual provoca distorções estruturais. As lesões mais comuns induzidas por luz UV são o ciclobutano de pirimidina (CPD) e o 6-4 pirimidina-pirimidona ((6-4)PP). Estas lesões podem ser reparadas pela fotorreativação, caracterizada por ter uma única enzima (fotoliase) que remove lesões como CPD ou (6-4)PP, empregando luz visível (300-500 nm) como fonte de energia. Foram identificados dois tipos de fotoliases que diferem por sua especificidade ao substrato: CPD-fotoliase e (6-4)-fotoliase. No trabalho anterior construímos vetores plasmidiais contendo o cDNA da CPD-fotoliase ou da (6-4)-fotoliase, sendo confirmada a expressão de ambas as proteínas em E. coli. Uma fração da proteína (6-4)-fotoliase foi obtida na forma solúvel. No entanto, a CPD-fotoliase, até o momento, só foi obtida na forma insolúvel. Neste trabalho pretendemos dar continuidade a estes experimentos buscando alternativas para obtenção de ambas as proteínas na forma solúvel (ativas). Com essas enzimas pretendemos investigar a importância dessas lesões em plasmídeos irradiados com solar, verificando, após a fotorreativação específica in vitro de um tipo de lesão, sobrevivência e mutagênese determinada após transfecção em bactérias. Além disso, com a obtenção concomitante de anticorpos para estas proteínas pretendemos, posteriormente, verificar a cinética de ligação e liberação dessas enzimas das lesões CPD e (6-4)PP em células humanas. |
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