AULA 06 - Busca avançada com BLAST

1. Criar uma sequência de proteína artificial que consista em RBP4 humana seguida pelo domínio C2 da proteína humana quinase Cα. Digite esta sequência combinada em um PSI-BLAST ou Pesquisa DELTA-BLAST. Em geral, vários domínios são sempre detectados por esses programas? Há alguma proteína que possui esses dois domínios naturalmente?


2. O objetivo deste problema é comparar o BLASTP com DELTA-BLAST. O parasita causador da malária Plasmodium vivax tem uma família multigênica chamada vir que é específica deste organismo (del Portillo et al., 2001 | Nature 410:839–842. PMID: 11298455). Existem 600–1000 cópias desses genes, e eles podem ter um papel na infecção crônica por variação antigênica. Selecione vir 1 e execute uma pesquisa BLASTP do banco de dados não redundante de proteínas (restringindo a espécie ao Plasmodium vivax). Em seguida, execute uma pesquisa DELTA-BLAST com o mesmo query. Para cada pesquisa, aproximadamente quantas proteínas têm um valor de E menor que 1 × 10^-10?


3. Existem globinas em fungos? Execute uma pesquisa no PSI-BLAST usando β-globina humana (NP_000509) como query, restringindo a saída a sequências de fungos (taxid: 4751) no banco de dados nr. Qual é o intervalo aproximado de comprimentos de proteínas de fungos com domínios de globina? Quais domínios não globina estão frequentemente presentes nas globinas de fungos? A presença desses domínios não relacionados leva à corrupção? Por que sim ou por que não? Na primeira iteração existem vários hits (com valores de E abaixo do limite de 0,005). Depois de mais diversas iterações existem muitas dezenas de hits, incluindo flavohemoproteínas que incluem um domínio de globina. Essas proteínas de fungos têm domínios da globina que estão mais relacionados a ortólogos bacterianos do que de vertebrados. A maioria das flavohemoproteínas de fungos são bastante longas (mais de 400 aminoácidos e às vezes cerca de 1000 aminoácidos de comprimento), tendo múltiplos domínios. No entanto, apenas o domínio de globina é usado para continuar as iterações do PSI-BLAST.


4. Realize buscas no HMMER. Primeiro faça dois diferentes HMMs. Você pode obter conjuntos de globina de vertebrados e bactérias/fungos/vertebrados de documentos A e B. Os vários alinhamentos que usamos como entrada para HMMER estão nesses documentos.
   
   Quando o perfil HMM é construído a partir de um alinhamento de múltiplas sequências de globinas α e β de vertebrados e usado para pesquisar o banco de dados RefSeq humano existem muitos matches no banco de dados, incluindo mioglobina (que não conseguimos detectar com BLASTP). Em contraste, quando um alinhamento de globinas de bactérias e de fungos são usadas para gerar um perfil HMM, o output consiste em um resultado com um valor esperado não significativo. Combinando várias globinas humanas com globinas de bactérias e globinas de fungos em um alinhamento de múltiplas sequências resulta na criação de um HMM que detecta prontamente as globinas humanas. O perfil HMM é, portanto, um modelo que é sensível para a escolha de sequências que são usadas como input para o alinhamento de múltiplas sequências.
   
   Os resultados completos de pesquisas no HMMER para globinas são: (1) vertebrados, (2) bactérias e fungos, e (3) bactérias, fungos e vertebrados. O match com mioglobina humana teve uma pontuação (score) mais alta e menor valor de E na pesquisa (3) do que na pesquisa (1). Estas buscas foram executadas localmente contra todas as proteínas RefSeq humanas.


5. Anteriormente executamos uma série de pesquisas por BLAST usando HIV-1 Pol (NP_057849) como query. Execute uma pesquisa BLASTP usando esse mesmo query. Olhe para o taxonomy report para ver quais vírus correspondem a essa consulta. Em seguida, repita a pesquisa usando DELTA-BLAST. Compare este taxonomy report ao da pesquisa com BLASTP. O que você pode observar? Existe alguma sequência não viral detectada na Pesquisa com DELTA-BLAST? Você esperava encontrar alguma?


6. Explore o PHI-BLAST usando RBP4 humana (NP_006735) como query, restringindo a saída a bactérias e o banco de dados RefSeq. Use o padrão PHI GXW[YF]X[VILMAFY]A[RKH]. Realize esta pesquisa e salve os resultados. Em seguida, repita a pesquisa usando o padrão PHI GXW[YF][EA][IVLM]. Como os resultados diferem? Selecione uma proteína que aparece como proteína bacteriana em um alinhamento de pares com a RBP4 humana usada como query; Quais são os valores de E e por que eles diferem?

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