Purificação de Vitelogeninas de Rabditídeos
(ref.: C.E. Winter - Comp. Biochem. Physiol., 103B:189, 1992)
1a. Pre-equilibrar a coluna de ConA-Sepharose com TH 1x.
01. Vermes, apos lavagem por flutuacao em sacarose 30%, congelados em
nitrogenio liquido e armazenados a -70oC.
02. Moer os vermes congelados em gral e ressuspender o po em volume igual
ao peso original de vermes de TAMPAO DE HOMOGENEIZACAO 2 X (TH 2X).
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| OBS.: ANTES DE ADICIONAR O TH 2X AO PO, ADICIONAR PMSF 100 mM, peps-|
| tatina 1mM e E-64 1mM para final 1mM, 20uM e 20 uM no TH 2X, |
| respectivamente. |
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03. Quebrar o DNA do homogenato passando por agulha numa seringa, para
diminuir a viscosidade.
04. Centrifugar 1500 xg por 5 min a 4oC.
05. Diluir o sobrenadante com TAMPAO DE HOMOGENEIZACAO 1 X (TH 1X).
06. Centrifugar 10000 x g por 5 min a 4oC.
07. Aplicar o sobrenadante desta ultima centrifugacao a coluna de Con A
SEPHAROSE (8-10 ml de volume) a um fluxo de 9,4 ml/h. OBS.: reservar
uma aliquota (20 ul) do sobrenadante para eletroforese.
08. Lavar a coluna com 150 ml de TH 1X durante 16h (overnight).
09. Eluir a vitelogenina ligada a coluna com TH 1X contendo 0,5M alfa-
metil manosideo. Coletar fracoes de 2,5 ml (15,6 min).
10. Retirar aliquotas de 50 ul de cada fracao para eletroforese.
Precipitar com TCA 10% final, lavar com acetona, secar e ressuspender
em 50 ul de Tampao de amostra para SDS-PAGE e correr 15 ul.
11. As fracoes com maior absorbancia devem ser dializadas contra NH4HCO3
25 mM e posteriormente liofilizadas.
REGENERACAO DA COLUNA:
01. Lavar com 200 ml de TAMPAO DE REGENERACAO 1 (TR 1) a 10 ml/h.
02. Lavar com 200 ml de TR 2 a 10 ml/h.
03. Lavar com 200 ml de TR 3 a 10 ml/h.
SOLUCOES:
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pepstat 2mM E-64 2mM TH TR 1 TR 2 TR 3
(200 x) (200 x) (2 x) (1 x) (1 x) (1 x)
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pesptatina 2,8 mg - - - - -
E-64 - 1,4 mg - - - -
Tris 1M pH 7,4 - - 10 ml - - -
Tris Base - - - - 2,4 g -
NaCl - - 17,5 g 5,84 g 5,84 g 11,7 g
CaCl2 1M - - 0,5 ml - - 200 ul
MnCl2 0,1M - - 5,0 ml - - 2,0 ml
HAc - - - 0,67 ml - 57,3 ul
NaOAc.3H2O - - - 1,13 g - 2,58 g
Ac. Borico - - - - 1,2 g -
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Agua para 2,0 ml 2,0 ml 250 ml 200 ml 200 ml 200 ml
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OBS.: 1. Para eluicao da vitelogenina ligada:
TH 2x ..................... 50 ml
alfa-metil manosideo ...... 9,7 g
Agua para 100 ml